Реферат: Гаметоциды и их применение в селекции

Реферат: Гаметоциды и их применение в селекции

Гаметоциды — химические соединения, применение .которых в опреде­ленные этапы развития растений приводит к гибели мужского гаметофи-та в результате нарушении метаболических процессов в период формиро­вания пыльцевых зерен. Действие гаметоцидов на физиолого-биохимиче-ские процессы в клетке аналогично стерилизующей цитоплазме при пере­мещении в нее ядра, что вызывает мужскую стерильность.

Исследования, проведенные в ряде стран, в том числе и в СССР, по­зволили выявить ряд химических соединений, которые индуцируют муж­скую стерильность у яровой и озимой пшеницы, ржи и других сельскохо­зяйственных культур. Использование гаметоцидов позволяет организовать Промышленное .производство гибридных семян зерновых и других сельско­хозяйственных культур. Однако полученные гаметоциды вызывают ряд по­бочных нежелательных явлений: значительное ингибирование роста, за­держку 'в прохождении .фенологических фаз и д'р. Поэтому необходим дальнейший поиск новых химических соединений, обладающих гаметоцид-ной активностью.

.

ВВЕДЕНИЕ

|Рост народонаселения планеты, необходимость повышения темпов производства продуктов сельского хозяйства опреде­ляют поиск новых направлений в селекции сортов и гибри­дов — основных средств сельскохозяйственного производства. В последнее время широкие исследования гетерозиса пшени­цы, ржи, ячменя, подсолнечника, сахарной свеклы, хлопчат­ника, ряда овощных, бахчевых, цветочных, декоративных культур и кормовых трав показали, что гибриды первого по­коления этих растений обеспечивают прибавку урожая на 20—25% и более по сравнению с районированными сортами [1,7, 35, 36].

Практическое использование гетерозисного эффекта воз­можно лишь при условии хорошо налаженного производства гибридные семян в значительном объеме. У ряда культур, об­ладающих высоким коэффициентом размножения семян и низкой посевной нормой (кукуруза, томаты и др.), производ­ство гибридных семян может быть организовано при ручной кастрации материнских растений с последующим свободным или принудительным опылением. Однако для большинства возделываемых растений этот метод неприменим, так как за­траты труда, необходимые для получения гибридных семян первого поколения, не окупаются дополнительно получаемой продукцией.

В настоящее время в результате использования явления цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) получены гибриды первого поколения пшеницы, сорго, кукурузы, сахар­ной свеклы, томатов, лука, сладкого перца и налажено мас­совое производство гибридных семян. Близки к завершению исследования по созданию гибридов ржи и подсолнечника [35]. Наряду с этим при селекции с томатами пытаются при­менить формы с функциональной мужской стерильностью [36]. 'Создание мужских стерильных линий, отбор линий — за­крепителей стерильности и форм, восстанавливающих фер-тильность, значительно усложнили ведение селекции я семе­новодства. Между тем основным недостатком использования системы «ЦМС — восстановление фертильноста» при получе­нии новых гибридных комбинаций скрещиваний является по­стоянная необходимость создания стерильных аналогов и аналогов '— восстановителей фертильности новых высокопродук­тивных сортов и самоопыленных линий.

Сравнительно недавно для индукции мужской стерильно­сти на растения в определенные фазы развития воздействова­ли различными физическими факторами (сокращенный све­товой день, высокие и низкие температуры и др.) [2, 48, 97, 130]. Несмотря на полученные положительные результаты» ввиду отсутствия технических средств для массового произ­водства гибридных семян эти приемы не были внедрены в практику.

•Определенные успехи в разработке методов мужской сте­рильности растений были достигнуты с помощью ряда хими­ческих соединений — растворов солей феноксиуксусной кис­лоты, гидразида малеиновой кислоты (ГМ1К), этрела, индо-лилуксусной   кислоты (ИУК), нафтнлуксусной кислоты (НУК), гиббереллина (ГКз) и некоторых других, названных гаметоцидами. Этот термин — производное от двух слов:

гамета — по-гречески половая клетка, цидо — по-латински убивать. В настоящее время в ряде стран Европы и в США проводят исследования по выявлению химических соединений, обладающих гаметоцядной активностью к мужскому гамето-фиту растений, и разрабатывают способы их применения для массового производства гибридных семян различных сельско­хозяйственных культур. Использование методов химической индукции мужской стерильности у зерновых, технических, овощных и кормовых культур позволит получить семена гиб­ридов первого поколения, вовлекая в селекционный процесс наиболее совершенные сорта без создания их стерильных ана­логов и линий, несущих гены восстановления фертильности.

Преодоление трудностей, препятствующих эффективному использованию гаметоцидов, в значительной мере зависит от определения сущности процесса стерилизации, в основе ко­торого лежат конкретные физиолого-биохимические измене­ния в тканевом метаболизме спорогенеза, вызывающие анор­мальности в развитии пыльцевого зерна с последующей его абортивностью. В связи с практическими запросами физиоло­гия развития пыльцы привлекает особое внимание.

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ, ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОРМИРОВАНИЯ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА

Мужской гаметофит покрытосеменных растений — микро­скопическая структура, которая в период ранних стадий раз­вития окружена тканями пыльника и непосредственно контак­тирует с клетками тапетума, метаболизм которых тесно свя­зан с развитием пыльцевьгх зерен, особенно в критические периоды преобразования материнских клеток пыльцы в гап-лоидные микроспоры. Так как наибольшая эффективность действия гаметоцидов приходится на период формирования тетрад и связана с биохимизмом их развития, возникает не­обходимость в детальной информации о ранних фазах разви­тия пыльцевого зерна в материнской клетке пыльцы.

С помощью электронной микроскопии установлено, что до мейоза материнские клетки пыльцы в пыльниках связаны между собой и с клетками тапетума цитоплазматлческими мостиками (плазмодесмами) [5, 59]. Перед стадией лептотены профазы 1 начинаются преобразовательные процессы в обо­лочках и мембранах микроспороцитов, которые быстро обво­лакиваются слоем каллозы, представляющей собой (3-1,3-свя-занный полимер глюкозы [130]. Это соединение локализуется между оболочками материнской клетки пыльцы и клеточной мембраной. С началом стадии лептотены плазмодесмы, сое­диняющие клетки тапетума и микроспороцитов, исчезают. Слой каллозы продолжает утолщаться, однако некоторые рай­оны оболочек микроспороцитов не покрываются каллозой, здесь соседние материнские клетки пыльцы контактируют друг с, другом с помощью широких цитоплазматичесиих пере­тяжек, названных цитомиксическими каналами [28]. У боль­шинства видов растений все микроспороциты мейотической профазы взаимосвязаны. Такая цитоплазматическая общ­ность — важнейший фактор поддержания тесной синхронно­сти мейотических стадий. Цитомиксические каналы начинают исчезать к концу мейотической профазы I, а в телофазе I их количество совсем незначительно, к началу же профазы II материнские клетки пыльцы полностью изолируются друг от друга каллозными оболочками. После мейоза каллоза обра­зует между четырьмя гаплоидными спорами тонкую прослой­ку (стадия тетрад), и каждая спора становится полностью изолированной от других. Предполагают, что в формирование каллозных оболочек вовлечен аппарат Гольджи [137].

Процесс формирования оболочки пыльцевого зерна начи­нается вскоре после завершения мейоза и протекает между клеточной мембраной я каллозной оболочкой в каждой спо­ре тетрады. Первичным материалом для построения оболочки является примэкзина. После развития прдмэкзины синтезиру­ется предшественник зрелой экзины, морфология которого .за­висит от его химического состава. По своим свойствам это вещество сходно с протоспоруллином. На данном этапе кал-лозная оболочка исчезает, споры быстро увеличиваются в размерах (в 3—5 раз) и интенсивно синтезируют спорополле-нин [70, 71]. После освобождения из тетрад в микроспорах формируется интина, содержащая микрофибряллы целлюло-5

зы, которые образуют матрикс с пектиновым материалом, ге-мицеллюлозой и незначительным количеством белка. До пол­ного созревания пыльцевое зерно покрывается различными производными распадающегося тапетума — каротиноидами, липидами, белками и другими соединениями [130]. При даль­нейших фазах развития пыльцы эффективность действия га-метоцидов снижается [47, 65, 75, 80, 102].

Ранние этапы развития пыльцы тесно связаны с функцио­нальной активностью тапетума. Цитохимические и ультра­структурные исследования свидетельствуют, что тапетум фун­кционирует как источник питательного материала при разви­тии пыльцевого зерна. У покрытосеменных установлено два основных типа тапетума: гландулярный, при котором клетки по мере развития пыльцевых зерен дегенерируют до П9лного автолиза, и амебоидный [76]. В последнем клетки теряют свою оболочку, и протопласт тапетума распределяется между раз­вивающимися пыльцевыми зернами, образуя тапетальный пе­риплазмодий [61]. Мембраны такого тапетума могут прони­кать в экзину пыльцы. Питательный материал транспортиру­ется из клеток та'петума (возможно, предварительно метабо-ли'аируется им) к пыльцевым зернам .[62]. Взаимодействие та­петума и развивающихся микроопор максимально проявляет­ся при растворении каллозных оболочек микроспор. Исчезно­вение каллозы сопровождается развитием каллазной актив­ности. Энзим локализован в везикулах цитоплазмы тапетума [130].

Исследование (3-1,3-глюканазной активности в течение мей-оза я распада тетрад показало, что активность энзима резко возрастала, начиная со II мейотдческого деления, достигала максимума в фазу освобождения микроспор из тетрад и со­хранялась затем в течение 48 ч [82, 131]. Доказательством взаимосвязи между развивающимися пыльцевыми зернами и тапетумом, а также подтверждением кардинальной роли та­петума в образовании пыльцы служат работы по ЦМС [59, Gl, 62, 76].

В связи с тем, что применение гаметоцидов имеет целью индукцию мужской стерильности растений, для выяснения предполагаемых механизмов действия веществ с гаметоцид-'ной активностью необходима сравнительная оценка и анализ морфологических, цитологических и физиолого-биохимиче-ских различий фертильных растений и линий с ЦМС. Срав­нительная анатомия и биохимия тканей пыльников нормаль­ных и стерильных растений свидетельствуют, что абортивность развивающихся пыльцевь»х зерен является результатом вклю­чения или выключения более чем одного механизма, а также нарушений регуляторных процессов на различных уровнях 6

контролирования метаболических путей [62, 94, 98, 111]. Отме­чено, что у всех изученных линий с ЦМС 90% растений обла^-дали нормальным ходом микроспорогенеза до определенной фазы, на которой начиналась абортивность пыльцы, и толь­ко у 10% растений анормальность проявлялась еще до ста­дии, обусловливающей абортивность в результате более ран­них нарушений нормальных метаболических циклов. У боль­шинства видов (около 70%) деградация микроспор приходи­лась на период, начиная с мейоза 1 и включая интерфазу микроспор [94].

Одной из причин, вызывающих ЦМС растений, являются функциональные нарушения в метаболизме тапетума. Тща­тельное изучение этой ткани у фертильных и стерильных ли­ний, а также у восстановителей фертильности сорго показало, что у фертильных линий после мейотической профазы I тапе­тум быстро уменьшался в радиальной протяженности [52]. В стерильных пыльниках радиально расширенный тапетум обусловливает абортивность микроспор, и период его разра­стания приходится на стадию вакуолизации микроспоры. Та­петум стерильных пыльников по протяженности (в ширине) и морфологии имеет более широкую шкалу изменчивости, чем у фертильных линий. 'Размеры ширины тапетума стерильных пыльников связывают с дегенеративными процессами в мик­роспорах [62, 109, 111].

•При цитологических исследованиях клонов ежи сборной с ЦМС не было отмечено отклонений в развитии пыльника в течение архиспориальной стадии и стадии материнской клет­ки пыльцы по сравнению с нормальными растениями [94, 117]. Первые признаки различий в развитии появлялись в началь­ные фазы мейоза, что выражалось в разрушении некоторых микроспороцитов, в результате чего образовывалось малое количество тетрад у растений с ЦМС. Одновременно у сте­рильных растений наблюдалось более быстрое дегенерирова-ние тапетума, чем у фертильных. При сравнительном иссле­довании микроспорогенеза и развития пыльцы у фертильных и стерильных растений льна установлено, что стерильность пыльцы у этого растения достигалась анормальным разрас­танием клеток тапетума, которые медленно дегенерировали по сравнению с тапетумом фертильных растений, у которых величина этой ткани быстро уменьшалась, особенно после стадии тетрад. Очевидно, преждевременное или позднее вклю­чение деградативньгх механизмов тапетума может быть при­чиной функциональной мужской стерильности. У разных ви­дов растений эти механизмы имеют свой специфический ха­рактер, что необходимо учитывать при подборе гаметоцидов, их доз и сроков обработки.

• Цитологические исследования пшеницы показали, что на клеточном уровне ЦМС выражается в уменьшении размеров и числа органелл, характеризующихся низкой физиологиче­ской активностью и довольно быстрым дегенерированием [59]. У фертильных пыльцевых зерен органеллы клеток обиль­ны.

Различный уровень метаболической активности тапетума в нормальных и стерильных пыльниках и продолжительность его функционирования контролируется цитологами реакцией Фёльгена. Ядра клеток тапетума нормальных пыльников ин­тенсивно окрашиваются до формирования материнской мик­роспоры, после чего окраска прогрессивно уменьшается по мере коллапсирования тапетума. В тканях тапетума стериль­ных пыльников окрашивание ядер продолжает осуществлять­ся интенсивно после формирования тетрад и незначительно снижается в процессе развития микроспор [94]. Следователь­но, функция тапетума неразрывно связана с его определен­ной ролью при абортивности микроспор. У нормальных пыль­ников тапетум получает необходимый питательный материал, поставляемый растением, и преобразует его для формирую­щихся микроспор, что подтверждается поступлением Фёль-ген-положительных веществ в материнскую микроспору во время мейоза [93]. Тапетум стерильных пыльников имеет бо­лее низкий уровень метаболической активности, о чем сви­детельствует как низкая энзиматическая активность, так и изменение поступления Фёльген-положительного материала в спорогенные клетки в критические периоды их формирова­ния.

В процессе 'химической индукции мужской стерильности может происходить включение тех же механизмов, что и пр.и абортивности мужского гаметофита стерильных аналогов, где стерильность обусловлена ЦМС. Обработка растений кори­андра, вики и лука 0,01%-ным раствором ГМК вызывала 100%-ную стерильность у всех трех растений [60, 89, 90]. Пос­ле нанесения гаметоцида на растения кориандра тапетум уве­личивался и существовал вплоть до стадии вакуолизации микроспор. У контрольных растений тапетум дегенерировал после мейоза. У лука Г1МК, включался в процессы формиро­вания пыльцы, способствуя преждевременному дегенерирова-нию спорогенной ткани и материнских клеток пыльцы. У ко­риандра химическое индуцирование мужской стерильности проявлялось цитологически — размер ядер не изменялся, а клетки тапетума значительно удлинялись.

Предполагают, что вмешательство различных факторов в метаболизм клеток тапетума приводит к деградации и'х со­держимого и, в первую очередь, дезокоирибозидов — основ-

8

ного синтетического пула ДйК, необходимого для нормаль­ного развития материнской клетки пыльцы и микроспор. На­рушение деятельности тапетума при снабжеаии питательным ^материалом спорогенной ткани, вызванное различными при­чинами, обусловливает начало процессов деградации мате­ринской клетки пыльцы [134, 137].

Цитологические исследования пыльников растений с аук-син-индуцированной стерильностью, выращенных при про­должительном освещении, показали, что химические и физи­ческие факторы могут способствовать преждевременному де-генерированию тапетума с последующим снижением нормаль­ного передвижения питательного материала к спорогенной ткани. В процессе нормального развития пыльцы в начальных (самых ранних) этапах микроспорогенеза ткани тапетума разрастаются и только после завершения формирования мик­роспор в материнской клетке пыльцы дегенерируют. При гор­мональной индукции мужской стерильности гиббереллином (ГКз) и в условиях длительного естественного освещения

•отмечена обратная корреляция во взаимодействии микроспор .и тапетума. Большинство микроспор становятся крупными, сильно вакуолизированньши, с ядром, прижатым к клеточной .стенке. Клетки тапетума образуют плотную оболочку вокруг

•полости пыльцевого мешка. Часть микроспор дегенерирует до вакуолизации, но большее их количество абортируется при цветении [94].

Аберрация микроспорогенеза в результате продленного дня, по-видимому, связана с ранним распадом клеток тапету­ма. Подобный эффект может быть достигнут путем обработ­ки ауксином, высокая концентрация которого обнаружена в тканях растений при длительном фотопериоде [78]. Это под­тверждает гипотезу о влиянии фотопериода на пол путем ре­гуляции метаболизма ауксинов в растительных тканях [84, 88].

Считают также, что нарушение функций тапетума в пита­нии развивающихся микроспор не является непосредственной и единственной причиной абортивности пыльцы [46, 107].

При сравнительных исследованиях пыльцы и развития

•пыльников линий пшеницы с ЦМС и нормальных растений установлено, что деградативные процессы в развивающихся пыльцевых зернах начинаются с несбалансированного поступ­ления питательных веществ в тапетум в результате наруше­ний функциональной активности васкулярной системы тычи­ночных нитей [31, 32, 87]. Последние у стерильных растений имели слабо дифференцированные васкулярные тяжи (либо они отсутствовали), в то время как у нормальных тычинок сосудистые элементы были хорошо дифференцированы на

9

ксилему и флоему. Наблюдаемое снижение аккумулирования крахмала в тканях тапетума и отсутствие запасного крахма­ла в зрелых микроспорах является следствием редукции пе­редвижения растворов (в частности углеводов) в тычинки стерильных растений [87]. Нарушение структуры васкулярных элементов при воздействии веществ с гаметоцидной активно­стью может быть одним из аспектов их действия, тем более, что обработка гаметоци.д'а'ми, как правило, сопровождается уменьшением размеров пыльников и длины тычиночных ни­тей [20, 59].

Преждевременное деградирование тапетума 'или. более длительное существование интактных клеток тапетума в пыльниках с мужской стерильностью, индуцированной хими­ческими препаратами, по-видимому, является результатом взаимосвязи химически активных веществ с деградативными энзимами (несвоевременная их индукция или блокирование) [56, 60, 74].

При исследовании причин абортивности пыльцы установ­лено повышение активности кислых фосфатаз в тканях нор­мальных пыльников до стадии тетрад, после которой актив­ность энзимтав резко снижалась с последующим дегенерирова-нием тапетума [56]. В тканях стерильных пыльников актив­ность энзимов была гораздо ниже, и набухший тапетум раз­давливал микроспоры [82].

.Подобный дисбаланс в энзиматической системе стериль­ных пыльников был отмечен S. Izhar и R. Frankel [82] при сравнительном изучении каллазной активности. В связи с тем, что период развития каллазной активности четко уста­новлен во времени и имеет определенный оптимум кислотно­сти (р.Н 5), авторы измерили in vivo pH различных стадий микроспорогенеза. У фертильных пыльников вплоть до позд­ней стадии тетрад р.Н составляла около 7, затем снижалась до 6, что сопровождалось растворением каллозы. В пыльни­ках растений линий с ЦМС pH обычно или низкая — тогда энзиматический распад каллозы материнской клетки пыльцы начинается раньше нормальных сроков, или высокая — тог­да наблюдается сильная активность энзима, начиная с про­фазы 1 в течение всего мейоза, вызывая цитологические на­рушения. Преждевременное повышение каллазной активности может быть причиной немедленного разрушения материнской клетки пыльцы. Торможение энэиматической активности кал-лазы блокирует распад каллозной оболочки материнских кле­ток пыльцы, в результате микроспоры теряют свои нормаль­ные очертания и деградируют.

Эти исследования позволили выявить новые причины абор­тивности пыльцы и показали, что в основе индукции мужской

10

стерильности лежит дисбаланс в четко скоординированные биохимических реакциях и нарушения в последовательности -„.нзиматических циклов. Изменение четкого ритма энзимати­ческой активности каллазы приводит к деградации развива­ющихся микроспор [2, 3, 4]. Экспериментально установлено, что период формирования тетрад является наиболее эффек­тивным для применения препаратов с гаметоцидной актив­ностью.

.Возможное участие гаметоцидов в процессах, обусловли­вающих торможение или .преждевременное освобождение микроспор из материнской клетки пыльцы, вероятно, связано с влиянием соединений с гаметоцндными свойствами на уров­ни энзиматической активности каллазы. Своевременная ин­дукция и развитие каллазной активности — критический пе­риод для нормального развития мужского гаметофита.

Для успешных поисков новых веществ, обладающих гаме­тоцидной активностью, необходимо располагать достаточной информацией о метаболизме спорогенной ткани и тапетума, а также о взаимосвязи вх обмена. Электронно-микроскопиче­ские наблюдения показали, что при нормальной метаболиче­ской взаимосвязи между клетками тапетума и развивающи­мися пыльцевыми зернами не наблюдается никаких аномалий [78]. Согласно имеющимся данным трудно определить, тапе­тум или спороциты являются 'инициатором -в нарушении взаимосвязи.

Одним из возможных путей выяснения механизма индук­ции мужской стерильности является исследование биохими­ческой активности тканей. При исследовании пыльников и экстр-актов листьев пшеницы установлено, что мужская сте' рильность пыльцы сопровождается репрессией активности терминальных оксидаз. Уровень активности цитохромоксида-зы в тканях фертильных растений по сравнению со стериль­ными гораздо выше [18, 27]. Подобное явление отмечено в тканях растений с генетической мужской стерильностью [46]. Цитохромоксидаза — неотъемлемый компонент мито-хондрий, поэтому низкую активность дыхательных энзимов растений с ЦМС можно объяснить дисбалансом митохондри-альных энзиматических систем [128].

Митохондрии, выделенные из стерильного материала (проростки пшеницы с ЦМС), характеризовались более вы­сокой окислительной фосфорилазной активностью, чем мито-хондрии из проростков с нормальной цитоплазмой [129]. Био­химические исследования и наблюдения электронной микро­скопии подтвердили, что мужская стерильность тесно связа­на с изменением функционального состояния этих структур клетки {15, 16, 63]. Восстановление фертильности в линиях

11

с ЦМ'С сопровождается одновременным устранением откло­нений в структуре цитоплазматических органелл и различных нарушений в метаболических процессах [27, 46]. Получены дополнительные доказательства в подтверждение гипотезы, что изменения в метаболизме митохондрий связаны с меха­низмами индукции мужской стерильности. Предполагается, что включение последних вызывает репрессию синтеза белков внутренней мембраны митохондрий [63, 114].

Однако было бы ошибочным считать, что только функцио­нальная активность митохондрий является основой возникно­вения цитоплазматической мужской стерильности. Ее индук­ция базируется на изменениях в широком диапазоне биохими­ческих реакций, обусловливающих нарушения в молекуляр­ных компонентах различных клеточных структур и цитоплаз­мы, что сопровождается появлением белков с анормальной эн-зиматической активностью. В результате этих изменений воз­никает дисбаланс в энзиматических системах или же полное их блокирование[8, 15, 20,82].

Для получения ЦМС путем химической индукции у сель­скохозяйственных культур необходимо детальное изучение метаболизма ДНК, РНОК и белка в стерильном и фертильном материале с цитологическим и цитохимическим сопоставлени­ем полученной информации. Изменения в содержании ДНК, РНК и белка в пыльниках кукурузы изучали методами цито­химии и микроденситометрии [101]. В процессе спорогенеза различали три пика интенсивного синтеза нуклеиновых кислот. Первый пик соответствует премейотическому периоду и ранней профазе, второй — приходится на интервал между поздним мейозом и стадией тетрад, третий (наименьший) — соответствует периоду, предшествующему митозу микроспор. В течение первого пика установлена самая высокая скорость роста спорогенной ткани и тапетума при активном синтезе молекулярных компонентов в обеих тканях. Во втором пике активный синтез ДНК, PlHiK и белка осуществляется в основ­ном в тканях тапетума. Торможение роста и параллельно син­теза этих молекулярных структур в спорах начинается в пе­риод третьего пика, при дегенерировании тапетума. В настоя­щее время тапетум рассматривают как возможный источник предшественников нуклеиновых кислот для формирующихся микроспор, которые получают материал для синтеза в форме растворимых предшественников или в форме ДНК с низким молекулярным весом [111, 130].

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5