Реферат: Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii

Реферат: Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii

Министерство общего и профессионального образования

Российской Федерации

Воронежский Государственный Педагогический Университет

Выпускная квалификационная работа по специальности 011000 «Химия»

«Исследование некоторых физико-химических свойств

протеиназы Penicillium wortmannii.»

                                                                      Исполнитель:

                                                                      ст-ка V курса

                                                                      Естественно-географического факультета

                                                                      Шишкина Е.Ф.

                                                                      Научный руководитель:

                                                                      кандидат технических наук, доцент

                                                                      Кочергина Н.И.

ВОРОНЕЖ 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.                                                                                                                    3

Глава 1. Обзор  литературы.                                                                                     5

1.1 Протеиназы  микробного происхождения.                                                        5

1.2 Ферменты, их физико-химические  свойства.                                                   9                                        

1.3 Выделение и очистка препаратов протеиназы.                                               13

1.4 Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение.                     17

Глава 2. Материалы и методы исследования.                                                       27

2.1 Определение рН.                                                                                                27

2.2 Определение протеолитической  активности.                                                27

2.3 Определение коллагеназной активности.                                                       27

2.4 Определение молекулярной массы.                                                                 28

2.5 Определение содержания аминного азота.                                                     28

2.6 Электрофоретические исследования.                                                              29

2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов                        29

2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ.                                                   30

Глава 3. Получение препаратов протеиназы Penicillium wortmannii 2091

и исследование их физико-химических свойств.                                                  31

3.1 Разработка условий выделения препарата

      Penicillium wortmannii BKMF 2091.                                                                 31

3.2 Фракционирование протеолитического комплексного

      препарата ферментов.                                                                                        36          

3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента.                                   37

3.4 Определение молекулярной массы.                                                                 40

3.5 Исследование процессов кислотной и термической инактивации.              40

3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента.     44

3.7 Субстратная специфичность.                                                                           46

3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья: ноги птиц, шквара.                        47

Глава 4.  Методическая часть.                                                                                57

4.1 Межпредметность – современный принцип обучения.                                 57

4.2   Межпредметные связи на уроках химии.                                                       61                                          

4.3   Методические рекомендации по реализации принципов

       межпредметных связей при изучении тем, связанных

       с понятием «ферментные препараты».                                                           63

Выводы.                                                                                                                    70

Список литературы.                                                                                                 71

ВВЕДЕНИЕ.

Важнейшим свойством ряда белков является их каталитическая активность. Вещества белковой природы, способные каталитически ускорять химические реакции, называют ферментами. Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено.

Биологические катализаторы по ряду признаков резко отличаются от неорганических катализаторов. Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.

Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат.  Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность – одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической  специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм ингибирующего действия сводится к двум типам торможения (необратимое и обратимое). Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным.

Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию, на чем основано их применение в различных областях промышленности. В хлебопекарной промышленности применяют ферментные препараты, относящиеся к роду Aspergillus. В пивоваренной и спиртовой промышленности применяют амилазы – ферменты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. В кожевенном и меховом производстве применяют препараты протеиназ. Ферменты находят большое применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу применяют для лечения заболеваний ЖКТ. Протеолитические ферменты – плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу – для растворения тромбов в кровеносных сосудах. Кроме того, специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика (заболевание может быть тестировано по уровню содержания фермента или соотношения его множественных форм в крови или реже в моче).  

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1        Протеиназы микробного происхождения.                                                                     

          Протеолитические ферменты синтезируются практически всеми живыми существами.  В промышленных целях как источник протеиназ используются животные ткани, растения и клетки микроорганизмов.  Наиболее перспективным источником протеиназ следует признать микроорганизмы по ряду существенных преимуществ, связанных, прежде всего, с неограниченностью источников, возможностью широко варьировать свойства методами селекции и генной инженерии, подбором условий биосинтеза, широким спектром ферментных комплексов и глубиной воздействия на различные субстраты, а так же простотой и относительной дешевизной технологии. 

Продуценты протеолитических ферментов обнаружены среди самых различных групп микроорганизмов: бактерий (Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas), микромицетов (Aspergillus, Rhizopus, Penicillium), актиномицетов (Streptomyces, Actinomyces).  На их основе у нас в стране и за рубежом создано крупнотоннажное производство ферментных препаратов протеолитического действия.

Многие широко распространённые микроорганизмы секретируют значительное количество протеолитических биокатализаторов в окружающую среду, что значительно облегчает задачу их выделения и очистки.  Возможность управления образованием ферментов за счёт подбора соответствующей питательной среды и условий культивирования позволяет не только увеличить выход протеолитических ферментов, но и получать ферментные препараты с определёнными свойствами.  Методы селекции и генной инженерии значительно увеличивают возможности целенаправленного биосинтеза ферментов.  Существенна способность микроорганизмов вырабатывать ферменты, уникальные по своей субстратной специфичности (кератиназы, коллагеназы, эластазы).

Большое внимание, уделяемое изучению протеолитических ферментов микроорганизмов, привело к получению значительного числа препаратов бактериальных и грибных протеиназ в высокоочищенном состоянии. 

В настоящее время в номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подклассам. По современной классификации протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз и образуют подкласс пептид-гидролаз, или протеаз.  Протеазы обычно подразделяются на пептидазы и протеиназы.  Однако чёткого разделения по этому признаку нет, так как установлено, что протеиназы (пепсин, трипсин,  папаин и другие) гидролизуют пептидные связи не только в белках, но и различных полипептидах. За последние годы значительно изменились представления о протеолитических ферментах. Согласно классификации Бергмана, подкласс пептид-гидролаз делится на две группы: эндопептидазы и экзопептидазы, которые отличаются специфичностью действия на субстрат.  Эндопептидазы гидролизуют пептидные связи, отщепляя последовательно концевые аминокислоты. Эндопептидазы могут действовать на центральные участки пептидной связи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты.  Экзопептидазы не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи и действуют, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты.

Необходимо отметить, что многие из протеолитических ферментов микробного происхождения получены в кристаллическом виде, например, субтилизин КФ 3.4.21.14, сериновая эндопептидаза  Alternaria КФ 3.4.21.16, сериновая протеиназа Arthrobacter КФ 3.4.21.14, кислая протеиназа Aspergillus oryzae КФ 3.4.23.6, кислая протеиназа Penicillium janthinellum КФ 3.4.26.6. и другие. Часто под одним номером находится очень много ферментов, получаемых из различных источников, но имеющих сходные свойства.

В промышленности чаще всего получают комплекс протеолитических ферментов, достоинства которого определяются с учётом аспектов последующего применения ферментного препарата.  Общая протеолитическая активность препаратов определяется на стандартных субстратах (казеине, гемоглобине, казеинате натрия) в соответствии с известными методами и используется для сравнения эффективности их действия на специфические субстраты (коллаген, эластин, кератин, желатин и т.д.).

Следует отметить, что у нас в стране проведены определённые исследования и обобщения по эффективности микробных протеиназ при расщеплении белков животных тканей. Однако лишь для немногих из них глубоко изучены физико-химические свойства, проведена идентификация функциональных групп каталитического центра, исследованы кинетика гидролиза субстратов и субстратная специфичность, расшифрована первичная структура.

Производство протеолитических препаратов организовано на основе микроскопических грибов родов Aspergillus и Rhizopus при поверхностном культивировании продуцентов, а также на основе бактерий Bacillus (subtilis, mesentericus, licheniformis, cereus и др.) при глубинном культивировании.

Протеиназы, полученные из этих культур, обладают высокой активностью.  Они находят широкое применение в различных отраслях промышленности для гидролиза животных и растительных белков. Среди микроорганизмов – продуцентов протеиназ не менее важное место,  чем бактерии, занимают актиномицеты Streptomyces (bradia, griseus, fradiospiralis). Впервые способность синтезировать протеиназы актиномицетами была показана Ваксманом, а затем Красильниковым. С тех пор большое число работ советских и зарубежных учёных посвящено изучению протеолитических ферментов актиномицетов [6, 17]. В настоящее время появились работы, где описано использование актиномицетов в качестве продуцентов кератиназы [24], эластазы [28], коллагеназы [26]. Однако промышленный выпуск протеиназ из актиномицетов развит слабо. Известны лишь препараты протеиназ Streptomyces griseus и Streptomyces fradie.

Однако проведение глубоких исследований ферментов у микроорганизмов осложняется высокой гетерогенностью синтезируемых протеолитических комплексов, требующих особо тонких и чувствительных методов выделения и очистки. Комплексные препараты, получаемые на практике, дают специфические эффекты при гидролизе субстратов. Так, например, протеолитические ферменты бактериального и грибного происхождения действуют в основном на белки мышечной ткани. Вместе с тем, известны комплексные препараты, проявляющие активность в отношении коллагена и эластина. При исследовании различных субтилизинов установлена их высокая каталитическая активность и невысокая специфичность гидролитического действия, что допускает их использование в различных пищевых технологиях.

Протеиназа из Actinomyces fradiae,отнесённая к типу трипсиноподобных, способна также гидролизовать казеин, денатурированный коллаген, но не активна в отношении эластина.

Из культуральной жидкости Bacillus mesentericum 316М выделяют комплексный ферментный препарат, обладающий высокой протеолитической активностью к фибриллярным белкам, в том числе коллагену и эластину.

Из отходов производства антибиотиков получен протеолитический препарат (источник Streptomyces griseus). Он обладает высокой казеинолитической активностью, подвергая при этом гидролизу гемоглобин, эластин, коллаген и желатин.

Получение высокоочищенных фракций ферментов – длительный, сложный и дорогой процесс, а применение комплексных препаратов не всегда даёт желаемый эффект и требует исследования условий гидролиза не только на чистых субстратах, но и при обработке сложных белковых систем. При этом интерес представляет как глубина протеолиза, так и качественная характеристика продуктов реакции, поскольку именно они определяют не только функциональные, биологические и технологические свойства продуктов, но и могут проявлять физиологические эффекты в составе пищи.

1.2       Ферменты, их физико-химические свойства.

Протеиназы, включающие ферменты микробного происхождения, составляют около половины производства препаратов на мировом рынке. Их эффективность и мощность намного превосходят синтетические катализаторы. Они высокоспецифичны по отношению к своим субстратам и ускоряют строго определённые химические реакции без образования побочных продуктов; ферменты функционируют в разбавленных водных растворах при физиологических значениях рН и температуры.

Ферменты – функциональные единицы клеточного  метаболизма. Действуя в строго определённой последовательности, они катализируют сотни многостадийных реакций, в ходе которых расщепляются молекулы питательных веществ, запасается и преобразуется химическая энергия, и из простых молекул-предшественников строятся макромолекулы, входящие в состав клетки.

Ферментативный катализ происходит на расстоянии длины химической связи, поэтому акт катализа совершается на определённом участке поверхности макромолекулы, называемом активным центром. Современный уровень экспериментальных исследований позволил доказать, что он представляет собой набор небольшого числа функциональных групп, расположенных близко друг от друга и имеет вид впадин, выемок  на поверхности молекулы фермента. Функциональные группы активного центра могут принадлежать звеньям полипептидной цепи, весьма удалённым друг от друга. Сближение их связано с формированием третичной структуры молекулы фермента.

Вполне логично, что активный центр не имеет автономного существования. Нельзя провести какую-либо грань между активным центром фермента и остальной частью белковой молекулы. Именно это и является одной из причин высокой чувствительности и лабильности активного центра к различным воздействиям.

К наиболее важным характеристикам ферментных препаратов, которые определяют  возможность их применения на практике, относят рН, температурный оптимум, субстратную специфичность. Кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН.

В 1964 году была получена в высокоочищенном состоянии нейтральная протеиназа Bacillus subtilis. Фермент имеет довольно широкий оптимум рН 6,5 – 8,0. В щелочной области рН её активность снижается, достигая при рН 9,0 – 30% максимальной величины. Таким образом, ферменты активны только в определённом интервале рН. В большинстве случаев для каждого фермента имеется определённый оптимум рН. Это объясняется несколькими причинами:

- истинное, обратимое влияние рН на скорость реакции (когда фермент насыщен субстратом);

- влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства);

- влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или обе стороны от оптимума.

Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом. Например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую – результатом инактивации фермента.

Итак, для всех известных ферментов зависимость скорости реакции от рН графически выражается в виде «колоколообразной» функции. Такие кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН.

Форма кривых, описывающих зависимость скорости ферментативной реакции от рН, отражает способность важных для данного фермента протон - донорных связей или протон – акцепторных групп в его каталитическом центре переходить при определённых значениях рН в состояние требуемой степени ионизации.

Методы анализа температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций основываются на классических принципах термодинамики и кинетики. Ферментативные реакции характеризуются также наличием «колоколообразной» зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком температурном интервале, что приводит к температурному оптимуму реакции. Эта способность влияния температуры на кинетику ферментативных реакций объясняется наложением двух эффектов (возрастание скорости реакции при увеличении температуры  и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах).

Многообразие форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных реакций, даёт основание ожидать, что анализ этого явления должен представлять большие трудности. В действительности, однако, влияние температуры легко установить экспериментально. Влияние этого фактора на стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных значениях температуры в течение определённого периода времени, а за тем определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остаётся стабильным. 

Хорошо изученными являются протеиназа из Bacillus amyloliguefarias [31] и протеиназа из Bacillus thermoproteolyticus (термолизин). Они довольно близки по своим свойствам. Однако термостабильность их значительно различается, так термолизин теряет 50% максимальной активности при температуре 84оС, за 15 минут при рН 7,2 , в то время как протеиназа Bacillus amyloliguefacieus теряет за то же время 50% активности при температуре 59оС. 

Ферментативная реакция в целом состоит, по крайней мере, из трёх последовательных стадий: образование фермент-субстратного комплекса, превращение этого комплекса в комплекс фермент-продукт и диссоциация промежуточного продукта. Влияние температуры на реакцию в целом является результатом её влияния на каждую из этих стадий.

Известно много ферментов, для которых естественные условия их действия не совпадают с оптимальными параметрами рН и температуры. Таким образом, внешние факторы позволяют с достаточным эффектом регулировать интересующие процессы, особенно при технологической обработке биологических объектов, например мяса и мясных продуктов.

Специфичность ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. По-видимому, только тогда, когда совпадение это достаточно полно, может образоваться фермент-субстратный комплекс и, следовательно, начаться процесс ферментативного катализа. Детальное изучение специфичности ферментов показало, что пределы её у разных ферментов различны. Одни ферменты обладают абсолютной специфичностью, т.е. каталитически ускоряют одну – единственную реакцию. Примером такого фермента может служить уреаза. Другие ферменты осуществляют катализ реакций определённого типа независимо от того, какие конкретные вещества в них взаимодействуют или распадаются. Основным признаком для ферментов этого типа является характер связи. Такие ферменты характеризуются, следовательно, групповой специфичностью. Наконец, некоторые ферменты отличаются стереохимической специфичностью, т.е. действуют только на один из пространственных изомеров. Примером могут служить ферменты, расщепляющие a- и b-метилглюкозиды.

Катализируемая химическая реакция представляет тот специфический признак, по которому один фермент отличается от другого. Современная классификация основана на этом признаке. Ферменты делят на группы в зависимости от типа катализируемой реакции и на подгруппы, более точно характеризующие эту реакцию.

Часто на практике протеолитические ферменты, известные и тем более мало изученные, подразделяются на группы в зависимости от оптимального значения рН действия на субстраты. Как правило, выделяют три группы:

1. Щелочные протеиназы, стабильные и активно действующие в области рН 5 – 10.  Максимальная их активность обнаруживается при рН  9,5 – 10,5. Установлено, что это главным образом сериновые протеиназы (для акта катализа важную роль играют функциональные группы серина); они активно ингибируются диизопропилфторфосфатом (ДФФ).

2.Нейтральные протеиназы с оптимумом рН для протеолиза около 7,0. В эту группу объединяют большинство металлоферментов, чувствительных к таким аддентам, как ЭДТА и о-фенантролин. Они не ингибируются ДФФ и тиоловыми реагентами, устойчивы при рН 6 – 9.

3.Кислые протеиназы, активные при рН 2 – 5, не чувствительные к сульфгидрильным реагентам, металлохелатным агентам, тяжёлым металлам и к ДФФ. Для акта катализа этой группы ферментов важны остатки карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Вместе с тем отметим, что зависимость активность – рН носит подчинительный характер и связана со структурой активного центра,

определяющего механизм действия. 

1.3       . Выделение и очистка препаратов протеиназы.

Современный уровень науки и техники позволяет получить не только комплексные, но и гомогенные, кристаллические ферменты. Их, как правило, выделяют непосредственно из биомассы гриба или культуральной жидкости, а так же из экстрактов поверхностных культур.

В качестве осадителей при получении комплекса препаратов протеиназ применяют сульфат аммония [14, 17], этанол [17], ацетон, изопропанол  [24].

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5